3.3.GSEA
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我们前面介绍的GO和KEGG是收集了大量基因集注释的两个数据库，而这里介绍的GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) 通常指的是一种统计方法。
GSEA最早在2005年的PNAS文章Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles中提出，此后在生物信息分析中一直被广泛使用，至今已有三万次以上的引用。
GSEA的基本步骤是：
首先，将所有（或者一批）基因按照上图A中Phenotype A/B两种条件下的表达差异的多少（例如Fold Change）排序；
同时，研究者已经有了一个基因集 ，如上图B中的Gene set S，S通常来自功能注释或其他的实验结果。
然后，检验Gene set S是否富集在这个排序表的顶端或者底端，计算一个Enrichment Score (ES)。
通常还会利用1000个或更多的shuffle的Gene Sets做为背景，计算很多背景的ES来估计一个FDR值。
进入 GSEA官方下载页面（需要登录方可进入，只需输入邮箱即可），可在安装列表中查找电脑对应版本安装图形化界面的版本。
安装fgsea包
注意：每次运行时注意要加载安装好的fgsea以及依赖的R包
我们只需要2个输入文件，所用到的文件可以直接从该链接中Files needed by this Tutorial中的清华云的Bioinformatics Tutorial / Files路径下的相应文件夹中下载响应文件。
基因排序(Rank list)：如Introduction图中，把所有（或者一批）基因按照Phenotype A/B两种条件下的表达差异的多少（如Fold Change）排个序。
基因集(Gene set): 如Introduction图中预设好的一个Gene Set S，通常来自功能注释或其他的实验结果。
Example of test.rnk：
example of test.gmx (推荐桌面版GSEA使用，用户还可以使用GSEA软件自带的gene set，例如可以在软件参数Gene sets database中选择相应的GMX文件）:
example of test.gmt (推荐fGSEA使用，GMT文件为GMX文件的转置）:
注意：
GMX文件开头两行格式固定，第一行为Gene sets的名字，第二行为Gene sets的label，前两行不可省略。
fGSEA现在只兼容GMT文件，第一列为Gene Sets的名字，第二列为Gene sets的label，前两列不可省略。
基因集文件中包含了两个Gene Sets，GSEA会分别对这两个Sets做两个GSEA的分析。
本节我们讲介绍如何利用一个自定义的基因排序(Rank list)和自定义的基因集(Gene set)进行富集分析，主要使用GseaPreranked模块。我们的示例文件中包含了两个Gene Sets，GSEA会分别对这两个Sets做两个GSEA的分析。
打开 GSEA，点击Load data，选择文件夹下相应文件test.rnk和test.gmx。
点击Run GseaPreranked, 选择合适的参数，如下图所示:
Gene set database选择上传的GMX文件，test.gmt。
Number of permutations选择1000。置换检验的次数，数字越大结果越准确，但是太大会占用太多内存，软件默认检验1000次。软件分析时会得到一个基因富集的评分（ES），但是富集评分是否具有统计学意义，软件就会采用随机模拟的方法，根据指定参数随机打乱1000次，得到1000个富集评分，然后判断得到的ES是否在这1000个随机产生的得分中有统计学意义。测试使用时建议填一个很小的数如10，先让程序跑通。真正分析时再换为1000。
Ranked List选择上传的RNK文件，test.rnk。
Collapse/Remap to gene symbols选择No_Collapse。因为这里不需要进行转换，如果GMX文件和RNK文件基因格式不同，咋需要上传.chip进行转换，如上述教程。
Basic fields中Max size需大于GMX文件中gene set大小，Min size需小于GMX文件gene set大小。这里Min size选1。
其他为默认参数。
运行成功后，Status 会显示为 Success，点击其即可查看输出。网页格式的输出信息，使用说明见 http://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideTEXT.htm#_Interpreting_GSEA_Results。
对R语言比较熟悉的同学可以利用叫做fgsea的R包进行批量的分析和绘图。
加载示例数据
运行fgsea进行自定义排序的分析
检查结果（按照p-value排序）
可视化基因set的富集结果
可视化多个基因set的富集结果
我们可以利用如下脚本重复之前在图形界面完成的GSEA的分析（我们的示例文件中包含了两个Gene Sets，GSEA会分别对这两个Sets进行分析）:
GSEA还可以有更多的分析，接受更多的输入文件格式，例如：
具体参见 http://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideTEXT.htm#_Preparing_Data_Files
可以通过qGSEA(一个R package)远程从在 GEO 中下载感兴趣的数据集（本例中我们使用 GSE19161)：
可得到文件目录结构如下：
GSEA也可以分析与离散型表型显著相关的 gene set （与差异表达相似），不同的地方在于 .cls 文件。以 GSE2251 例，打开链接后，可以在 Samples 一栏找到样品信息（样本数过多时，网页会显示不全，这时可以解压并打开 _series_matrix.txt.gz 查看样本信息。）。 本例共有12个样本，其中第1, 2, 3, 7, 8, 9 号为"E2-8"，第4, 5, 6, 10, 11, 12 号为"vehicle"。针对这一表型的.cls 文件如下所示**：**
12 是样本总数，2 是表型类型数目，0 代表第一种表型，1 代表第二种表型。
注意：
由于表型文件(cls文件)为离散型，选择参数时Basci fields中Metric for ranking genes应选择signal2noise、t-Test、ratio_of_class、 diff_of_class、log2_ratio_of_class之一。
由于基因芯片仅分析一部分基因，有些 gene set 会因为包含的基因过少而被剔除 。在极端情况下，可能所有的 gene set 都会被剔除，这时就会发生如下错误：
更多信息请参见http://software.broadinstitute.org/cancer/software/gsea/wiki/index.php/1001
对一套Gene Set (KEGG_CELL_CYCLE.v2022.1.Hs.ensg.gmt) 在我们的Ranked Genes (COAD.tumor.vs.normal.rnk) 上做GSEA分析，数据可从https://cloud.tsinghua.edu.cn/d/ad22768345664924b202/?p=%2FFiles%2FPART_II%2F3.2.gsea下载。
利用图形界面进行分析，提交中间过程和最后结果，截图并解释。
利用fGSEA进行分析，提交代码及最终结果，并解释。
| Format | Description | Notes |
|---|---|---|
| Format | Description | Notes |
|---|---|---|
test.rnk
The RNK file contains a single, rank-ordered gene list (not gene set) in a simple newline-delimited text format.
Rank list
test.gmx/gmt
The GMX/GMT file format is a tab-delimited file format that describes gene sets. This file can contain multiple gene sets:
In the GMX format, each column represents a gene set.
In the GMT format, each line represents a gene set.
Gene Sets
txt, res, gct, pcl
A dataset containing expression value for each feature in each sample.
一批基因的表达值
cls
Associates each sample with a phenotype label.
基因在不同样品下的表达值
Chip
Lists each probe and its matching HUGO gene symbol.
基因 ID 和基因名字对应表
