2.2.Ribo-seq Analysis
本章为Ribo-seq数据处理的说明，分为Prepare Data Matrix和Data analysis两大部 分。
- Part I.Prepare Data Matrix：完成样本的Reads Processing、Remove RNA and Mapping工作，得到Mapped reads(bam)并绘制质量控制相关图，计算Ribo-seq reads count matrix。
- Part II.Data analysis：完成差异翻译效率分析。
- 利用Xtail基于Ribo-seq的count matrix 和RNA-seq的count matrix计算差异翻译效率。为了方便对比RNAseq只统计CDS区域的reads。
Ribo-seq测序数据位于
/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/data/riboshape_liulab_batch4/Ribo-seq 这里我们以(CR1_1,CR1_2,CR1_3)为例。这里我们通过脚本进行样本的批量处理，分为fastqc，trimmed，remove_rRNA，mapping，read_count_HTSeq 5个脚本，每个脚本路径我们在下面详细说明。
这步操作主要是检查数据的质量，脚本参考
/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/1.fastqc.shInput：
data type | path |
raw data | /CR1*.fq.gz |
Software/Parameters：
fastqcoptions | function |
-q --quiet | 禁止在标准输出上显示所有进度，仅报告错误；安静模式 |
-o --outdir | 指定输出目录 |
-h --help | 选项的详细介绍 |
-t 4 | 设置线程数 |
--noextract | 指定结果文件压缩 |
Output：
\*.html：质控报告解读的网页文件。\*.zip：网页文件中画图的数值及图片。
因此
fastqc结果仅看html即可。这里使用
fastp默认参数，对数据自动进行全方位质控，脚本参考：/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/2.trimmed.shSoftware/Parameters：
fastpoptions | function |
-i | read1 输入文件名 |
-o | read1 输出文件名 |
-I | read2 输入文件名 |
-O | read2 输出文件名 |
--thread=4 | 指定线程数为4 |
-l --length_required 15 | 短于指定长度的reads将被丢弃，默认为15，即长度<15的read被去掉 |
--length_limit | 设置read最大长度，默认为0，即没有最大长度限制。 |
-j --json filename | 设置输出的json格式的质控结果文件名，不设置则默认json文件名为fastp.json |
-h --html filename | 设置输出html格式的质控结果文件名，不设置则默认html 文件名为fastp.html |
usage: fastp -i <in1> -o <out1> [-I <in1> -O <out2>] [options...]Output :
eg:
CR1_1.clean.fq.gzfastp质控后的数据。CR1_1.html/CR1_1.json:质控结果报告文件。
使用
bowtie将上一步中得到的fastp质控后的*.clean.[1/2].fastq.gz文件比对到rRNA index上，除去这部分比对到rRNA index的部分，从而得到不含rRNA reads的文件.fastq文件。参考脚本:/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/3.remove_rRNA.shInput :
1.2)操作结束后的
\*.clean.fq.gz。Software/Parameters :
bowtie 可以Clean rRNA reads得到不含rRNA reads的.fastq文件。options with Parameter Setting | function |
-n N | 代表在高保真区内的错配不能超过N个，这里设置为0，即不允许任何错配 |
-a | 在允许的错配碱基数量下的全部可能的比对情况都输出 |
-m1 --best -strata | 只报告最好的比对情况的那一个输出 |
-p 4 | 指定使用4个线程 |
-l L | 代表序列高保真区的长度，最短不能少于5，这里我们设置为L=15 |
--un *rm_rRNA.fq | 输出不能map到指定基因组上的reads，fasta格式。即我们所需要的去除rRNA后的文件 |
-S | 输出文件名，格式为.sam |
-1/-2 | 对于PE测序数据，-1指定输入的read1文件，-2指定输入的read2文件 |
reference：
bowtie -n 0 -y -a --norc --best --strata -S -p 4 -l 15 \
--un ~/*.rm_rRNA.fq \
~/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.34.rRNA \
-1 ~/*.clean.fastq.gz \
-2 ~/*.clean.fastq.gz \
~/*.aligned_rRNA.txt
Output
*rm_rRNA.fq：不含rRNA reads的.fastq文件,位于fastq文件夹。- map到rRNA index上的
*aligned_rRNA.txt。
gzip压缩*rm_rRNA.fq文件，得到*rm_rRNA.fq.gz文件。由于PartI.RNA-seq analysis中我们已经创建了参考基因组目录。这里直接使用已经创建好的
genome directory即可，不做详细描述。我们使用
STAR软件对1c)操作得到的*rm_rRNA_[1/2].fq进行比对。参考脚本：/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/4.mapping.shSoftware/Parameters :
STARoptions with Parameter Setting | function |
--runThreadN Number_of_Threads | set number of threads |
--limitBAMsortRAM 20000000000 | maximum available RAM for sorting BAM |
--outFilterType BySJout | reduces the number of "spurious" junctions |
--outFilterMismatchNmax 10 | alignment will be output only if it has no more mismatches than this value |
--genomeDir /path/to/genomeDir | path to genom directory |
--readFilesIn /path/to/read1 /path/to/read2 | path to input files |
--readFilesCommand 'zcat' | If the read files are compressed, use the --readFilesCommand UncompressionCommand option,for gzipped files (.gz) use --readFilesCommand zcat |
--outFileNamePrefix | output files name prefix |
--outSAMtype BAM Unsorted | output unsorted Aligned.out.bam file |
--quantMode TranscriptomeSAM GeneCounts | With --quantMode TranscriptomeSAM option STAR will output alignments translated into transcript coordinates in the Aligned.toTranscriptome.out.bam file |
--outSAMattributes All | The SAM attributes can be specified by the user using --outSAMattributes |
--outSAMstrandField intronMotif | For unstranded RNA-seq data, Cufflinks/Cuffdiff require spliced alignments with XS strand attribute, which STAR will generate with --outSAMstrandField intronMotif option |
--outBAMcompression 6 | int:-1 to 10 BAM compression level |
--outReadsUnmapped Fastx | output of unmapped and partially mapped reads in separate file;Fastx:output in separate fasta/fastq files, Unmapped.out.mate1/2 |
reference：
以
CR1_1样本为例：STAR \
--runThreadN 4 \
--outFilterType BySJout \
--outFilterMismatchNmax 2 \
--outFilterMultimapNmax 1 \
--genomeDir genomedir \
--readFilesIn ~/CR1_1.rm_rRNA.fq.gz \
--readFilesCommand 'zcat' \
--outFileNamePrefix CR1_1. \
--outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
--quantMode TranscriptomeSAM GeneCounts \
--outSAMattributes All \
--outSAMattrRGline ID:1 LB:ribo_seq PL:ILLUMINA SM:CR1_1 \
--outBAMcompression 6 \
--outReadsUnmapped Fastx
- outFilterMultimapNmax=1，是因为不考虑Multimap reads注意部分参数的选择与
differential expression的选择不同，为什么不同，请大家自行思考。
output：
.Aligned.out.sorted:比对结果文件。.toTranscriptome.out.sorted：比对到转录本上的reads组成的文件。
这里我们使用
samtools sort -T按TAG值排序，随后使用samtools index对排序后的序列建立索引。输出为bai文件。output :
.Aligned.sortedByCoord.out.bam.Aligned.toTranscriptome.out.sorted.bam.Aligned.sortedByCoord.out.bam.bai.Aligned.toTranscriptome.out.sorted.bam.bai
这里我们使用
mapping后并且经过samtools排序索引后的比对结果文件作为输入。使用htseq-count软件来计算reads数。参考脚本：/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/5.read_count_HTSeq.shinput：
.Aligned.sortedByCoord.out.bam
Software/Parameters :
htseq-countoptions with Parameter Setting | function |
-f bam | 设置输入文件 的格式 |
-s no | 设置是否是链特异性测序 |
-i gene_id | 设置feature ID是由gtf/gff文件第9列哪一个标签决定的 |
-t CDS | 设置指定的feature进行表达量计算 |
-m union | 设置表达量计算模式，可有的参数值有union, intersection-strict and intersection-nonempty。真核生物推荐使用union模式 |
reference：
htseq-count \
-f bam \
-s no \
-i gene_id \
-t CDS \
-m union \
~/*.Aligned.sortedByCoord.out.bam \
~/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.34.gtf > ~/.read_count.HTSeq.txt
注意，由于Ribo-seq测序数据，仅测到被核糖体保护的片段，因此这里我们仅设置
CDS模式。得到的
read_count.HTSeq.txt中包含着以__开头的注释信息。因此需要进行以下处理。# 提取其中的__开头的信息。
grep __ ~/*.read_count.HTSeq.txt > ~/*.read_count.HTSeq.txt.summary
# 除去其中的__开头的信息
sed -i '/^__/d' ~/*.read_count.HTSeq.txt
output：
read_count.HTSeq.txt：包含gene_id与reads counts的信息。read_count.HTSeq.txt.summary：汇总信息。
在这里我们给出Ribo-seq的6个样本的bam和reads count结果，以及RNA-seq的6个样本的reads counts在统计CDS模式下的结果。
- Ribo-seq 6个样本的Bam文件：
/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/result/PartII.Ribo-seq_analysis/3.mapping - Ribo-seq 6个样本合并后reads matrix文件是：
/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/result/PartII.Ribo-seq_analysis/6.Differential_translation_efficiency/Ribo-seq - RNA-seq 6个样本CDS区域reads matrix文件是:
/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/result/PartII.Ribo-seq_analysis/6.Differential_translation_efficiency/RNA-seq-CDS/count_CDS.txt,这里我们只用每个RNA的CDS区域的reads
Ribosome profiling data with a good quality tend to have a good 3-nt periodicity. 这里我们使用
RiboCode中的metaplots来获得3-nt periodicity分析报告。 参考脚本为：/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/6.RiboCode_metaplot.shinput：
.Aligned.toTranscriptome.out.bam：1.d.3)中mapping后并且经过samtools排序索引后的比对结果文件。/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/data/Ribocode/RiboCode_annot:由RiboCode产生的一些注释文件目录。
Software/Parameters：
metaplotsoptions with Parameter Setting | function |
-a | 设置RiboCode注释文件夹路径 |
-r | 设置输入的sam文件路径 |
-o | 设置输出路径 |
-m 26 | 设置最小值 |
-M 34 | 设置最大值 |
reference：
metaplots \
-a /data/TA_QUIZ_RNA_regulation/data/Ribocode/RiboCode_annot \
-r ~/*.Aligned.toTranscriptome.out.sorted.bam \
-o ~/RiboCode/metaplot \
-m 26 \
-M 34 \
-s no \
-pv1 0.05 \
-pv2 0.05
output：
~/RiboCode/metaplot：输出目录，目录中包含3-nt periodicity分析的pdf文件。*.Aligned.toTranscriptome.out.sorted.pdf：pdf文件。
我们利用
Xtail基于Riboseq的count matrix和RNAseq的count matrix计算差异翻译效率。为了方便对比RNAseq只统计CDS区域的reads。使用R包
xtail进行差异翻译分析。 参考脚本：/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/9.xtail.R注：
/data/zhaoyizi/software/anaconda3/envs/Riboshape/bin/下的R未安装xtail软件，安装了xtail的R脚本为：/BioII/lulab_b/liuxiaofan/software/conda2/bin/Rscript运行xtail软件步骤如下：
##### 以下操作均在服务器命令行窗口运行 #####
### 进入文件传输通道，未进入文件传输通道中是无法访问/BioII文件夹的
ssh tmgt
### 运行脚本
/BioII/lulab_b/liuxiaofan/software/conda2/bin/Rscript /path/to/your/9.xtail.R
input：
WT_count.txtcount_CDS.txt
reference：
# 读取riboseq和mrna的reads counts matrix。
ribo <- read.table('~/wt_count.txt',header=T,quote='',check.names=F, sep='\t',row.names=1)
mrna<- read.table('~/count_CDS.txt',header=T,quote='',check.names=F, sep='\t',row.names=1)
# 样本信息
condition <- c("control","control","treat","treat","treat")
# 获得xtail分析结果，按照q-value排序，选择输出log2FCs和log2R
results <- xtail(mrna,ribo,condition,minMeanCount=1,bins=10000)
results_tab <-resultsTable(results,sort.by="pvalue.adjust",log2FCs=TRUE,log2Rs=TRUE)
# 输出xtail分析结果
write.table(results_tab,"~/wt.0-vs-1.TE_new.xls",quote=F,sep="\t")
output：
输出结果为/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/result/PartII.Ribo-seq_analysis/7.TE/wt.0-vs-1.TE_new.csv 输出结果未进行差异基因 过滤。
Last modified 2yr ago