1.Mapping
二代测序数据种类繁多，分析方法也各有差异。在待分析的物种已有参考基因组的情况下，传统的高通量数据分析流程中通常都会把测序数据mapping回参考基因组(对RNA-seq在有一些情况下有的流程也会考虑向转录组mapping)，再用mapping的结果（通常是一个bam格式的文件）进行后续的分析。
0)准备运行环境
进入我们之前使用的docker容器:
docker exec -it bioinfo_tsinghua /bin/bash
# 进入本节课的工作目录
cd /home/test/mapping1) 流程
2) 文件格式
2a) fastq文件
fastq文件是存储二代测序测出的reads序列的最常见的一种文件格式。
fastq文件除了read的序列信息之外，还记录了每一个碱基的测序质量信息
fastq文件中，每四行对应一个read，下面提供了一个简单的例子。
第1行以"@"开头，"@"后面记录了read id，read id后面还可以空一格，再加上一些相关的描述信息
第2行记录着read序列
第3行以"+"开头，通常包含一些相关的描述信息(如果为空，也需要一个"+"作为占位符)
第4行为ASCII码表示的每个碱基的测序质量，长度和第2行相等
@EAS54_6_R1_2_1_413_324
CCCTTCTTGTCTTCAGCGTTTCTCC
+
;;3;;;;;;;;;;;;7;;;;;;;88fastq文件可以很容易的转换成fasta文件，但这一步会丢失测序质量的信息。大部分mapping的软件也支持fasta文件格式作为输入
对于双端测序，两个end的reads通常放在两个fastq文件中，在这两个fastq文件中，对应同一个read pair的两个read次序是一致的(例如对于第一个fastq文件中的第43个record对应的read，与它paired的read位于第二个fastq文件的第43个record)。
2b) sam文件
sam/bam 文件是存储二代测序数据mapping结果的最常见的文件格式, mapping的过程可以简单的理解为一个从fastq文件产生bam文件的过程
sam文件为纯文本文件，bam文件为压缩后的二进制文件。在实际工作中bam文件更常用(因为比较节约存储)
sam/bam文件一般由两部分组成: 第一部分称为header，它包含了reference序列的名称及长度，mapping结果的排序方式，mapping使用的软件等信息；第二部分为sam/bam文件的主体，包含了reads mapping的信息
在不考虑multiple alignment(一个read被比对到多个位置)和chimeric alignment(一个read的不同区域被比对到了不同的染色体等)的情况下，一条read mapping的结果通常对应着sam/bam文件主体部分的一行
sam/bam文件可以包括unmapped reads，也可以不包括unmapped reads
pair end reads mapping的结果通常存储在一个bam文件中
sam/bam 文件的具体定义相对比较复杂，对细节感兴趣的同学可以参考https://samtools.github.io/hts-specs/SAMv1.pdf
samtools为我们操纵sam/bam文件提供了很多非常方便的功能，我们将在samtools/bedtools一节进行具体介绍
3) unspliced reads mapping
在向基因组mapping各个物种的DNA-seq(以及原核生物的RNA-seq)数据，或向转录组mapping各个物种的RNA-seq数据时，一般不需要考虑RNA splicing的问题。
我们这里主要介绍bowtie的基本使用。
# 将fasta文件中THA1.fa的reads mapping到酵母基因组上
bowtie -v 2 -m 10 --best --strata BowtieIndex/YeastGenome -f THA1.fa -S THA1.sam
# -v 2: 最多容许2个mismatch
# -m 10: 只输出可以map到不超过10个位置的reads mapping的结果
# --best --strata: 只汇报最好的一个hit,两个参数需要同时指定
# BowtieIndex/YeastGenome: 酵母的bowtie index,可以从https://bowtie-bio.sourceforge.net/manual.shtml下载，也可以用bowtie-build从基因组文件自己建立
# -f THA1.fa: 输入为fasta文件，路径为THA1.fa
# -S THA1.sam: 输出文件名为THA1.sam，格式为sam文件
# 将fastq文件e_coli_1000_1.fq中的reads mapping到大肠杆菌基因组上
bowtie -v 1 -m 10 --best --strata bowtie-src/indexes/e_coli -q e_coli_1000_1.fq -S e_coli_1000_1.sam
# -v 1: 最多容许1个mismatch
# -m 10: 只输出可以map到不超过10个位置的reads mapping的结果
# --best --strata: 同上
# bowtie-src/indexes/e_coli 大肠杆菌的bowtie index,可以从https://bowtie-bio.sourceforge.net/manual.shtml下载，也可以用bowtie-build从基因组文件自己建立
# -q e_coli_1000_1.fq: 输入为fastq文件
# -S e_coli_1000_1.sam: 同上4) Genome Browser
5) 延伸阅读
5a) 基因组学的常用文件格式
详见 http://genome.ucsc.edu/FAQ/FAQformat.html。
5b) spliced mapping
对于真核生物的RNA-seq数据的处理，我们通常需要考虑RNA splicing的问题。
mapping RNA-seq数据的工具通常还需要提供一个gtf注释文件以获得splicing位点的信息，再向index mapping测序数据，产生bam文件。
这里我们也提供了利用STAR软件向拟南芥基因组mapping RNA-seq reads的例子。
在docker镜像中下载STAR的release并解压(在宿主机下载后，通过共享目录在docker中使用当然也是可以的):
wget https://github.com/alexdobin/STAR/archive/refs/tags/2.7.10a.zip
unzip 2.7.10a.zip下载所需的数据STAR.mapping.tar.gz放入容器内的当前工作目录并解压:
tar xvzf STAR.mapping.tar.gz建立STAR index:
mkdir tair10.Pt.STARindex
STAR-2.7.10a/bin/Linux_x86_64_static/STAR --runMode genomeGenerate --genomeFastaFiles data/tair10.Pt.fa --sjdbGTFfile data/tair10.Pt.gtf --genomeDir tair10.Pt.STARindex --genomeSAindexNbases 7
# genomeSAindexNbases 是STAR suffix array pre-indexing 的字符串长度, 默认为14
# 对于比较小的基因组(例如我们这里只用到了叶绿体序列，可以理解成一个很小的基因组)一般会设成min(14, log2(GenomeLength)/2 - 1)mapping
mkdir output
STAR-2.7.10a/bin/Linux_x86_64_static/STAR --runMode alignReads --genomeDir tair10.Pt.STARindex --readFilesIn data/ath_1.fastq data/ath_2.fastq --outFileNamePrefix output/ath.aligned在输出目录中，
output/ath.alignedAligned.out.sam是mapping产生的sam文件，output/ath.alignedSJ.out.tab是splice junction的信息，其余两个是STAR输出的日志文件，包括mapping结果的统计信息等。
6) Homework
（1）请阐述bowtie中利用了 BWT 的什么性质提高了运算速度？并通过哪些策略优化了对内存的需求？
（2）用bowtie将
THA2.famapping 到BowtieIndex/YeastGenome上，得到THA2.sam，统计mapping到不同染色体上的reads数量(即统计每条染色体都map上了多少条reads)。（3）查阅资料，回答以下问题:
（3.1）什么是sam/bam文件中的"CIGAR string"? 它包含了什么信息?
（3.2）"soft clip"的含义是什么，在CIGAR string中如何表示？
（3.3）什么是reads的mapping quality? 它反映了什么样的信息?
（3.4）仅根据sam/bam文件的信息，能否推断出read mapping到的区域对应的参考基因组序列? (提示:参考https://samtools.github.io/hts-specs/SAMtags.pdf中对于MD tag的介绍)
（4）软件安装和资源文件的下载也是生物信息学实践中的重要步骤。请自行安装教程中未涉及的bwa软件，从UCSC Genome Browser下载Yeast (S. cerevisiae, sacCer3)基因组序列。使用
bwa对Yeast基因组sacCer3.fa建立索引，并利用bwa将THA2.fa，mapping到Yeast参考基因组上，并进一步转化输出得到THA2-bwa.sam文件。
7) More Reading
如上所述，mapping本身用到的都是一些现成的，高度优化的工具，需要我们自己完成的工作不多。
很多情况下我们直接拿到的测序数据在mapping前需要进行对各种adaptor和linker的移除、对质量不好的raw reads的trim和丢弃等data clean和QC工作。这是需要一定的经验的，而且对于不同测序方法产生的数据，预处理的方法也有所不同。这需要我们对产生数据的实验方法有清晰了解，illumina团队把现有的所有二代测序建库技术都收集并整理成标准，免费查看。请参考Sequence Method Explorer (中文版链接为https://www.illumina.com.cn/science/sequencing-method-explorer.html?langsel=/cn/)。
对于数据的QC和预处理，也有大量工具可以直接使用，最常用的有:
fastqc: 统计多种QC指标，以html的形式进行可视化
cutadapt: 用于去除adaptor和低质量序列
trim_galore:对cutadapt进行了封装，自动识别常见adaptor
fastp:国人开发的fastq预处理工具
fastx_toolkit 一个比较早期的fastq预处理工具
8) Teaching Video
see Videos in the **** Files needed
Take a break
Illumina & Affymetrix
“Illumina公司的市场数据实在是非常美妙的东西。”拥有个人博客的基因研究人员丹尼尔·麦克阿瑟（Daniel Macarthur）说，“它是如此地纯净，到了令人吃惊的地步。” 当Illumina公司目前的股价净值比高达84倍的时候，高盛仍然建议买入，声称该公司很有可能继续保持其在DNA测序领域里的领导地位。
Illumina毫无疑问是这个时代科技公司的榜样。在生物学仪器制造领域，跟Thermo，Life等拥有几十年历史的公司相比，1998年起源于加州圣地亚哥的Illumina显然还是个年轻小伙。从1999年25个人的规模、130万美元的年营业额，到2013年超过3200人的规模、14.21亿美元的年营业额。
今天，Illumina公司几乎垄断了所有的二代测序（NGS：Next Generation Sequencing）市场。但是，Illumina公司最初是一家生产DNA芯片（microarray chip)的公司，这是一种侦测DNA变异的早期技术。而且，那时的Illumina公司还落后于该市场缔造者Affymetrix公司。
Illumina今天已经赶超了Affymetrix，并将其远远抛之脑后。最主要的原因，在于它从DNA芯片到DNA测序上的成功转型。Illumina公司的成功，很多人归功于其CEO，Jay Flatley，在战略上的敏锐。他很可能称得上是生物科技领域里的最佳CEO。2006年，Flatley说服Illumina公司董事会以6亿美元的价格收购了一家叫Solexa的开发NGS技术的小公司（同类型的NGS技术公司还有454等，因为其技术、成本和市场上的弱势，今天已经很少有人听说了），借此大力押注DNA测序。
如今，illumina在二代测序（NGS：Next Generation Sequencing）乃至整个测序市场占据领导地位。引用illumina官方说法：“世界上90%以上的测序数据都由illumina仪器产生”，不较真的话，这句话确实在某种程度上反应了illumina雄踞NGS市场的现状（下图是illumina 测序产品发布时间线） 。尤其是HiSeq系列测序仪的问世，以通量高，产量大，生产规模著称，能够快速、经济的进行大规模平行测序，在大型全基因组测序，全转录组，全外显子组测序，靶向基因测序方面优势明显。
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