2.2.Ribo-seq Analysis
本章为Ribo-seq数据处理的说明,分为Prepare Data Matrix和Data analysis两大部分。
Part I.Prepare Data Matrix:完成样本的Reads Processing、Remove RNA and Mapping工作,得到Mapped reads(bam)并绘制质量控制相关图,计算Ribo-seq reads count matrix。
Part II.Data analysis:完成差异翻译效率分析。
利用Xtail基于Ribo-seq的count matrix 和RNA-seq的count matrix计算差异翻译效率。为了方便对比RNAseq只统计CDS区域的reads。
Part I.Prepare Data Matrix
0) 数据说明
Ribo-seq测序数据位于/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/data/riboshape_liulab_batch4/Ribo-seq
这里我们以(CR1_1,CR1_2,CR1_3)为例。
1) Mapping
这里我们通过脚本进行样本的批量处理,分为fastqc,trimmed,remove_rRNA,mapping,read_count_HTSeq 5个脚本,每个脚本路径我们在下面详细说明。
1.1) QC of raw data
这步操作主要是检查数据的质量,脚本参考/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/1.fastqc.sh
Input:
data type
path
raw data
/CR1*.fq.gz
Software/Parameters:
fastqc
options
function
-q --quiet
禁止在标准输出上显示所有进度,仅报告错误;安静模式
-o --outdir
指定输出目录
-h --help
选项的详细介绍
-t 4
设置线程数
--noextract
指定结果文件压缩
Output:
\*.html
:质控报告解读的网页文件。\*.zip
:网页文件中画图的数值及图片。
因此fastqc
结果仅看html
即可。
1.2) Cut adaptor & trim long read
这里使用fastp
默认参数,对数据自动进行全方位质控,脚本参考:/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/2.trimmed.sh
Software/Parameters:
fastp
options
function
-i
read1 输入文件名
-o
read1 输出文件名
-I
read2 输入文件名
-O
read2 输出文件名
--thread=4
指定线程数为4
-l --length_required 15
短于指定长度的reads将被丢弃,默认为15,即长度<15的read被去掉
--length_limit
设置read最大长度,默认为0,即没有最大长度限制。
-j --json filename
设置输出的json格式的质控结果文件名,不设置则默认json文件名为fastp.json
-h --html filename
设置输出html格式的质控结果文件名,不设置则默认html 文件名为fastp.html
usage: fastp -i <in1> -o <out1> [-I <in1> -O <out2>] [options...]
Output :
eg:
CR1_1.clean.fq.gz
fastp质控后的数据。CR1_1.html
/CR1_1.json
:质控结果报告文件。
1.3) Clean rRNA reads
使用bowtie
将上一步中得到的fastp
质控后的*.clean.[1/2].fastq.gz
文件比对到rRNA index
上,除去这部分比对到rRNA index
的部分,从而得到不含rRNA reads
的文件.fastq
文件。参考脚本:/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/3.remove_rRNA.sh
Input :
1.2)操作结束后的\*.clean.fq.gz
。
Software/Parameters :
bowtie
可以Clean rRNA reads得到不含rRNA reads的.fastq
文件。
options with Parameter Setting
function
-n N
代表在高保真区内的错配不能超过N个,这里设置为0,即不允许任何错配
-a
在允许的错配碱基数量下的全部可能的比对情况都输出
-m1 --best -strata
只报告最好的比对情况的那一个输出
-p 4
指定使用4个线程
-l L
代表序列高保真区的长度,最短不能少于5,这里我们设置为L=15
--un *rm_rRNA.fq
输出不能map到指定基因组上的reads,fasta格式。即我们所需要的去除rRNA后的文件
-S
输出文件名,格式为.sam
-1/-2
对于PE测序数据,-1指定输入的read1文件,-2指定输入的read2文件
reference:
Output
*rm_rRNA.fq
:不含rRNA reads的.fastq
文件,位于fastq文件夹。map到rRNA index上的
*aligned_rRNA.txt
。
gzip
压缩*rm_rRNA.fq
文件,得到*rm_rRNA.fq.gz
文件。
1.4) Mapping
1.4a) Generating genome index
由于PartI.RNA-seq analysis中我们已经创建了参考基因组目录。这里直接使用已经创建好的genome directory
即可,不做详细描述。
1.4b) Running mapping jobs
我们使用STAR
软件对1c)操作得到的*rm_rRNA_[1/2].fq
进行比对。参考脚本:/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/4.mapping.sh
Software/Parameters :
STAR
options with Parameter Setting
function
--runThreadN Number_of_Threads
set number of threads
--limitBAMsortRAM 20000000000
maximum available RAM for sorting BAM
--outFilterType BySJout
reduces the number of "spurious" junctions
--outFilterMismatchNmax 10
alignment will be output only if it has no more mismatches than this value
--genomeDir /path/to/genomeDir
path to genom directory
--readFilesIn /path/to/read1 /path/to/read2
path to input files
--readFilesCommand 'zcat'
If the read files are compressed, use the --readFilesCommand UncompressionCommand option,for gzipped files (.gz) use --readFilesCommand zcat
--outFileNamePrefix
output files name prefix
--outSAMtype BAM Unsorted
output unsorted Aligned.out.bam file
--quantMode TranscriptomeSAM GeneCounts
With --quantMode TranscriptomeSAM option STAR will output alignments translated into transcript coordinates in the Aligned.toTranscriptome.out.bam file
--outSAMattributes All
The SAM attributes can be specified by the user using --outSAMattributes
--outSAMstrandField intronMotif
For unstranded RNA-seq data, Cufflinks/Cuffdiff require spliced alignments with XS strand attribute, which STAR will generate with --outSAMstrandField intronMotif option
--outBAMcompression 6
int:-1 to 10 BAM compression level
--outReadsUnmapped Fastx
output of unmapped and partially mapped reads in separate file;Fastx:output in separate fasta/fastq files, Unmapped.out.mate1/2
reference:
以CR1_1
样本为例:
outFilterMultimapNmax=1,是因为不考虑Multimap reads
注意部分参数的选择与
differential expression
的选择不同,为什么不同,请大家自行思考。
output:
.Aligned.out.sorted
:比对结果文件。.toTranscriptome.out.sorted
:比对到转录本上的reads组成的文件。
1.4c) samtools sort &index
这里我们使用samtools sort -T
按TAG值排序,随后使用samtools index
对排序后的序列建立索引。输出为bai
文件。
output :
.Aligned.sortedByCoord.out.bam
.Aligned.toTranscriptome.out.sorted.bam
.Aligned.sortedByCoord.out.bam.bai
.Aligned.toTranscriptome.out.sorted.bam.bai
1.4d) Reads counts
这里我们使用mapping
后并且经过samtools
排序索引后的比对结果文件作为输入。使用htseq-count
软件来计算reads数。参考脚本:/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/5.read_count_HTSeq.sh
input:
.Aligned.sortedByCoord.out.bam
Software/Parameters :
htseq-count
options with Parameter Setting
function
-f bam
设置输入文件的格式
-s no
设置是否是链特异性测序
-i gene_id
设置feature ID是由gtf/gff文件第9列哪一个标签决定的
-t CDS
设置指定的feature进行表达量计算
-m union
设置表达量计算模式,可有的参数值有union, intersection-strict and intersection-nonempty。真核生物推荐使用union模式
reference:
注意,由于Ribo-seq测序数据,仅测到被核糖体保护的片段,因此这里我们仅设置CDS
模式。
得到的read_count.HTSeq.txt
中包含着以__
开头的注释信息。因此需要进行以下处理。
output:
read_count.HTSeq.txt
:包含gene_id与reads counts的信息。read_count.HTSeq.txt.summary
:汇总信息。
Part II.Data analysis
0) 数据说明
在这里我们给出Ribo-seq的6个样本的bam和reads count结果,以及RNA-seq的6个样本的reads counts在统计CDS模式下的结果。
Ribo-seq 6个样本的Bam文件:
/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/result/PartII.Ribo-seq_analysis/3.mapping
Ribo-seq 6个样本合并后reads matrix文件是:
/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/result/PartII.Ribo-seq_analysis/6.Differential_translation_efficiency/Ribo-seq
RNA-seq 6个样本CDS区域reads matrix文件是:
/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/result/PartII.Ribo-seq_analysis/6.Differential_translation_efficiency/RNA-seq-CDS/count_CDS.txt
,这里我们只用每个RNA的CDS区域的reads
1) 周期性和ORF分析
Ribosome profiling data with a good quality tend to have a good 3-nt periodicity. 这里我们使用RiboCode
中的metaplots
来获得3-nt periodicity
分析报告。 参考脚本为:/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/6.RiboCode_metaplot.sh
input:
.Aligned.toTranscriptome.out.bam
:1.d.3)中mapping
后并且经过samtools
排序索引后的比对结果文件。/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/data/Ribocode/RiboCode_annot
:由RiboCode
产生的一些注释文件目录。
Software/Parameters:
metaplots
options with Parameter Setting
function
-a
设置RiboCode注释文件夹路径
-r
设置输入的sam文件路径
-o
设置输出路径
-m 26
设置最小值
-M 34
设置最大值
reference:
output:
~/RiboCode/metaplot
:输出目录,目录中包含3-nt periodicity
分析的pdf文件。*.Aligned.toTranscriptome.out.sorted.pdf
:pdf文件。
2) Differential translation efficiency
我们利用Xtail
基于Riboseq
的count matrix
和RNAseq
的count matrix
计算差异翻译效率。为了方便对比RNAseq
只统计CDS
区域的reads
。
使用R包xtail
进行差异翻译分析。 参考脚本:/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/script/PartII.Ribo-seq_analysis/9.xtail.R
注:/data/zhaoyizi/software/anaconda3/envs/Riboshape/bin/
下的R未安装xtail软件,安装了xtail的R脚本为:/BioII/lulab_b/liuxiaofan/software/conda2/bin/Rscript
运行xtail软件步骤如下:
input:
WT_count.txt
count_CDS.txt
reference:
output:
输出结果为/data/TA_QUIZ_RNA_regulation/result/PartII.Ribo-seq_analysis/7.TE/wt.0-vs-1.TE_new.csv 输出结果未进行差异基因过滤。
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